曼联与西汉姆联:匯百試劑:細菌總蛋白和膜蛋白提取方法


西汉姆联对莱斯特城
裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,調pH值至8.5-9.0備用;
溶菌酶;蛋白酶抑制劑PMSF;1% SDS溶液;Trizol裂解液;無水乙醇;異丙醇;0.3M鹽酸胍;
疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,調pH值至8.0備用。
 
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高速離心機;超聲儀;透析袋;EP管;渦旋儀;水浴鍋等。
 
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1. 從新鮮樣品中提取總蛋白(簡易法)
 
1) 自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,調pH值至8.5-9.0備用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50ml 裂解液/1g濕菌體。
 
2) 將40ml 菌液在12000g,4℃下離心15分鐘收集菌體,沉淀用PBS懸浮洗滌2遍,沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體。
 
3) 超聲粉碎,采用300w,10s超聲/10s間隔,超聲20min,反復凍融超聲3次至菌液變清或者變色。
 
4) 1000g離心去掉大碎片,上清可直接變性后PAGE電泳檢測,或者用1% SDS溶液透析后凍存。
 
缺點:Western blotting結果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
 
2. 從Trizol裂解液中分離總蛋白
 
1) Trizol溶解的樣品研磨破碎后,加氯仿分層,2-8℃下10000g離心15min,上層水相用于RNA提取,體積約為總體積的60%。
 
2) 用乙醇沉淀中間層和有機相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml無水乙醇混勻,室溫放置3min,2-8℃不超過2000g離心5min。
 
3) 將上清移至新的EP管中,用異丙醇沉淀蛋白質。每使用1ml Trizol加入1.5ml異丙醇,室溫放置10min,2-8℃下12000g離心10min,棄上清。
 
4) 用含有0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1ml Trizol加入2ml洗液,室溫放置20min, 2-8℃下7500g離心5min,棄上清,重復洗滌2次。最后加入2ml無水乙醇,渦旋后室溫放置20min,2-8℃下7500g離心5min,棄上清。
 
5) 冷凍干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反復吹打,50℃溫浴使其完全溶解,2-8℃下10000g離心10min去除不溶物。
 
6) 替代方案:將3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,1000g離心10min去除沉淀,上清可直接用于蛋白實驗。
 
3. 從新鮮樣品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污劑法)
 
1) 配制疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,調pH值至8.0備用。
 
2) 菌液于4℃條件下15000g離心15min收集菌體;用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗滌3次,最后于4℃條件下15000g離心15min收集菌體。
 
3) 菌體沉淀加入1ml冷提取液,于4℃條件下放置2h,17000g離心10min,去除沉淀取上清。
 
4) 將上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性,37℃條件下放置10min使其分層。室溫下1000g離心10min使液相和去污相充分分層。
 
5) 將液相和去污相分開,分別用10倍體積的冷丙酮在冰上沉淀45min。
 
6) 于4℃條件下17000g離心30min,用去離子水洗滌沉淀3次。
 
7) 將沉淀溶解在1% SDS溶液中,測定蛋白濃度,比較液相和去污相中蛋白提取效率,一般是去污相中疏水性膜蛋白較多,適于進一步蛋白實驗。
 
8) SDS-PAGE進一步分析液相和去污相的蛋白圖譜。

素材來源于網絡。
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