西汉姆联队赞助:汇百试剂:细菌总蛋白和膜蛋白提取方法


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裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,调pH值至8.5-9.0备用;
溶菌酶;蛋白酶抑制剂PMSF;1% SDS溶液;Trizol裂解液;无水乙醇;异丙醇;0.3M盐酸胍;
疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,调pH值至8.0备用。
 
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高速离心机;超声仪;透析袋;EP管;涡旋仪;水浴锅等。
 
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1. 从新鲜样品中提取总蛋白(简易法)
 
1) 自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,调pH值至8.5-9.0备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。
 
2) 将40ml 菌液在12000g,4℃下离心15分钟收集菌体,沉淀用PBS悬浮洗涤2遍,沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。
 
3) 超声粉碎,采用300w,10s超声/10s间隔,超声20min,反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。
 
4) 1000g离心去掉大碎片,上清可直接变性后PAGE电泳检测,或者用1% SDS溶液透析后冻存。
 
缺点:Western blotting结果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。
 
2. 从Trizol裂解液中分离总蛋白
 
1) Trizol溶解的样品研磨破碎后,加氯仿分层,2-8℃下10000g离心15min,上层水相用于RNA提取,体积约为总体积的60%。
 
2) 用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3min,2-8℃不超过2000g离心5min。
 
3) 将上清移至新的EP管中,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇,室温放置10min,2-8℃下12000g离心10min,弃上清。
 
4) 用含有0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液,室温放置20min, 2-8℃下7500g离心5min,弃上清,重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇,涡旋后室温放置20min,2-8℃下7500g离心5min,弃上清。
 
5) 冷冻干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反复吹打,50℃温浴使其完全溶解,2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。
 
6) 替代方案:将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,1000g离心10min去除沉淀,上清可直接用于蛋白实验。
 
3. 从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污剂法)
 
1) 配制疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,调pH值至8.0备用。
 
2) 菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体;用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次,最后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。
 
3) 菌体沉淀加入1ml冷提取液,于4℃条件下放置2h,17000g离心10min,去除沉淀取上清。
 
4) 将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性,37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。
 
5) 将液相和去污相分开,分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min。
 
6) 于4℃条件下17000g离心30min,用去离子水洗涤沉淀3次。
 
7) 将沉淀溶解在1% SDS溶液中,测定蛋白浓度,比较液相和去污相中蛋白提取效率,一般是去污相中疏水性膜蛋白较多,适于进一步蛋白实验。
 
8) SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。

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