曼联与西汉姆联足球:?RIPA裂解液的原理解析


RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分均有较强裂解作用,RIPA裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的Western、IP等。
RIPA裂解液的原理如下。
RIPA主要是从动物组织和动物细胞中抽取的可溶性蛋白。RIPA 组织/细胞裂解液是利用表面活性剂等来裂解细胞膜(包括核膜)。
索莱宝高校RIPA裂解液的使用方法
如发现RIPA有沉淀,请放室温半小时或者常温水浴使沉淀溶解。 
根据使用量,取每1ml RIPA 加入10ul PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM?;煸缺赣?(PMSF现用现加)。 

1、样品前处理: 
a)对于贴壁细胞:去除培养液,用 PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照 6 孔板每孔细胞量加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。 
b)对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照 6 孔板每孔细胞量加入 150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液,再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。 
c)对于组织样品: 把组织剪切成细小的碎片。按照每20mg组织加入150-250 ul裂解液的比例加入裂解液。 (如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量)。
用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。 
2、后处理: 
将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。 
注意事项 : 
强烈型裂解液,可以提取核蛋白,但在提取核蛋白的同时,也会将基因组一并释放出来,造成细胞裂解液粘稠,此时可以直接加入蛋白上样缓冲液,煮沸再离心,离心后直接上样电泳;若想测定浓度,可入加少量 SDS(1%),煮沸后离心测浓度。本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂,所以不适合使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒,请选择BCA法或者Lowry法检测蛋白浓度。

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